 日志正文
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中枢神经系统的细胞移植临床研究已经获得疗效。近年来的研究表明，皮肤、骨髓和脂肪组织中的干细胞可以分化为神经细胞。脂肪组织容易获得，人体脂肪来源的基质细胞在体外可以大量培养，在一定的条件下可分化为成骨细胞、软骨细胞、成肌细胞和脂肪细胞。由于这种基质细胞的多能性，有文献称之为脂肪组织来源的基质细胞（adipose tissue-derived stroml cells,ADSCs）。进一步研究发现，在体外研究发现了大鼠ADSCs向神经细胞分化的线索，提示了这种细胞有临床应用的可能，进一步尝试应用体外诱导的方法促进人类ADSCs向神经细胞分化。 方法是在成年人皮下脂肪组织在外科手术时获取，并且征得病人同意。无菌条件下进行细胞培养方法，原代培养生长至融合时传代细胞（3~9代）种植在3.5cm培养皿中，待细胞达到70%~80%的融合时，加入诱导分化的培养基，即DMEM/10%胎牛血清的基础培养基中加入0.5mM 的异丁基甲基黄嘌呤、1μM地塞米松、10μM胰岛素和200μM消炎痛,诱导分化2周后，培养皿中出现的神经元样细胞和脂肪细胞不再增多，进行免疫细胞化学检查和苏丹黑B染色。直接在培养皿上进行免疫细胞化学检查。结果原代培养的细胞在低密度的状态下是长梭型细胞，在细胞长满培养瓶趋于融合时，细胞体变得细长，形态极像成纤维细胞（图1）。在体外培养可传代20次以上，细胞表达中胚层来源细胞的标志物波形蛋白（图2），大部分细胞也表达巢蛋白（图3）、神经元特异性烯醇化酶（图4）和βⅢ管蛋白（图5）。ADSCs在异丁基甲基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素和消炎痛的诱导下，培养皿中在1周左右出现神经元样细胞（图6）和含有脂滴的脂肪细胞。分化2周后培养皿中的神经元样细胞不再增多。此时分化的神经元样细胞的比例为0.1-0.2%。神经元样细胞表达波形蛋白、巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶和βⅢ管蛋白。有趣的是，部分分化的神经元样细胞也表达平滑肌肌动蛋白（图7）。诱导分化和未诱导的细胞均无胶质纤维酸性蛋白、半乳糖脑苷脂、髓鞘基础蛋白和S100的表达，说明无星型胶质细胞和少突胶质细胞的产生。3代到9代的细胞均可在同样的诱导条件下分化为神经元样细胞和脂肪细胞。 由于神经移植的研究最近20年在临床研究上获得了明显的进步，应用胎儿来源的脑组织移植治疗帕金森病已经获得肯定的疗效，而且有形态学证据的支持。但是这种治疗方案应用的是人类胚胎，涉及到伦理、法律和道德问题。因此，获得新的细胞来源用于中枢神经系统移植是我们的必然选择。目前开发的移植细胞主要有三种策略：（1）利用自体神经细胞体外培养扩增后再移植到中枢神经系统内，可以克服异体移植的免疫排斥。但中枢神经系统细胞位置深在，获取细胞必然对组织造成损伤，体外培养扩增也有一定的技术困难。（2）取流产胚胎的脑组织，分离神经干细胞，在体外大量培养扩增后移植到中枢神经系统内，但这样必然面临着伦理学的问题而无法回避。（3）取异种胚胎神经细胞（如猪和鼠）培养后移植。但该方法可能会出现安全性和免疫排斥。近年的研究证明成年体内的干细胞有跨分化现象，中胚层来源的细胞可以分化为神经细胞，这为神经移植提供了新的细胞来源。我们对骨髓基质细胞研究时发现，丹参注射液可以诱导这种细胞向神经元样细胞分化，进一步验证了国外的研究结果。在对大鼠ADSCs细胞培养的同时，发现这种细胞可以表达神经细胞表型，能够在相似的诱导条件下分化为神经元样细胞。ADSCs在一定条件下都能分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和肌肉细胞，大鼠ADSCs有巢蛋白和神经元特异性烯醇化酶 mRNA的表达，即使不用诱导，在培养皿中也有偶然分化的神经元样细胞，ADSCs在β—巯基乙醇的诱导下可向神经元样细胞分化，细胞的分化过程和速度与骨髓基质细胞相似，早期分化的细胞表达巢蛋白和神经元特异性烯醇化酶，晚期表达神经微丝。分化的细胞形态和表达相应的标志物证明了这种分化的细胞表达神经细胞表型。在前期的研究基础上，我们应用类似的诱导方案对人类的ADSCs进行分化研究，但由于种属的差异，人类ADSCs没有明显的神经分化现象。异丁基甲基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素和消炎痛联合作用可以诱导骨髓基质细胞和ADSCs向脂肪细胞分化，在向脂肪细胞的诱导同时，我们发现有神经元样细胞产生，重复多次实验都获得相似的结果。这几种物质的神经诱导作用的机理目前还不清楚。人类的ADSCs表达神经干细胞的标志物波形蛋白和巢蛋白，同时细胞也表达神经元的标志物βⅢ管蛋白和神经元特异性烯醇化酶，说明ADSCs可以表达神经细胞表型。在一定的诱导条件下可以分化为神经元样细胞。但这种神经元样细胞是否有神经递质分泌，移植到脑内是否发挥功能，目前正在研究之中。ADSCs移植治疗脑缺血的动物模型可以改善脑缺血的疾病症状，在体内能够表达神经元和星型胶质细胞的表型。但这不能排除细胞融合的可能，不能得出ADSCs分化为神经细胞的结论。至于动物模型的疾病症状改善，也可能归功于移植细胞的营养作用。我们发现分化的神经元样细胞仍然表达平滑肌肌动蛋白，而成熟的神经元是不会表达SMA的。这种跨分化而来的神经元样细胞具有典型的神经元的形态。 我的相关日志：
最后修改于 2014-05-27 18:12
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