 日志正文
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细胞的能量代谢状态是否会影响水通道蛋白1（AQP1）的表达。用体外培养的Balb/c 3T3小 鼠成纤维细胞株fibroblasts，用肌酸激酶抑制剂碘乙酰胺（IA）作用于该细胞，应用免疫印迹和免疫组化技术检测细胞在0、4、6 h时AQP1 的表达。结果细胞与IA 作用4 h 后，AQP1 表达开始增加，至6 h 时AQP1 表达大量增加，同时伴有细胞死亡；RT-PCR发现AQP1 mRNA显著增加，干扰线粒体功能的微管抑制剂及呼吸链细胞色素c氧化酶阻断剂同样诱导了AQP1的表达。结论IA诱导Balb/c 3T3小鼠成纤维细胞AQP1的大量表达存在着转录前的调节，并且具有线粒体相关的能量依赖性。 应用BALB/c 3T3 小鼠成纤维细胞株（中科院上海细胞库）；DMEM、优质胎牛血清（Gibco 公司）；BCA蛋白分析试剂盒（Pierce 公司）；抗兔IgG、ECL-plus（Amersham 公司）；蛋白酶抑制剂（Boelinger 公司）；碘乙酰胺（IA）、诺考达唑、叠氮化钠（Sigma-Aldrich公司），AQP1 抗体，免疫组化染色系统（Santa Cruz 公司）；青霉素、链霉素（LifeTech 公司），PVDF 膜（Bio-Rad 公司）。Trizol（Invitrogen 公司）；TakaRaRNA Kit（AMV）Ver.3.0（TakaRa公司）。 细胞培养小鼠成纤维细胞用含有10%胎牛血清的DMEM培养液（青霉素40 U/ml，链霉素40 μg/ml）培养，置于37 ℃、5% CO2的孵箱中。细胞90%单层融合时传代，按5×105/孔的密度接种到60 mm培养皿中，培养24 h 细胞完全贴壁后用于试验。将细胞分为0 h 组，4 h 组及6 h 组，并于上述各时间点分别加入碘乙酰胺（30 μmol）、诺考达唑（50 μg/ml 或100 μg/ml）或叠氮化钠（20 mmol），分别收集细胞并冻结。1.2.2 免疫组化细胞爬片24 h 后，与IA 共同孵育，到达观察终点时取出载玻片放入冷4%多聚甲醛中固定30 min，0.1% Triton-X-100 室温孵育30 min，过氧化物酶作用5 min，血清封闭20 min；滴加1∶1000 稀释后的AQP1 一抗，于湿盒中4 ℃孵育过夜；37 ℃复温30 min，加二抗30 min 孵育，加SABC 30 min 孵育。显微镜下DAB 染色，苏木素复染；系列酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片。采用Metamorph/DP10/BX41 显微图像分析系统，测定细胞AQP1 表达的平均光密度值。 蛋白检测（Western blotting）AQP1 检测用冰-细胞裂解液重悬浮细胞沉淀，形成一个冻融循环。细胞上清以BSA为标准，用BCA试剂盒测定蛋白浓度。将20 μg 细胞溶解产物进行SDS/PAGE（12%）凝胶电泳，并且将免疫印记蛋白转印到PVDF膜上，以1∶500 浓度的AQP1 抗体于4 ℃孵育过夜，化学发光（ECL plus）和放射自显影术显像。采用Motic ImagesAdvanced 3.2 图象分析系统测定显影的条带光密度值。 RT-PCR 引物由TaKaRa 合成，AQP1 上游引物：5'-GCTTGTCTGTGGCCCTTGG-3'，下游引物：5'-AAGTTGCGGGTGAGCACAG-3'。β-actin 上游引物：ATATCGCTGCGCTGGTCGTC，下游引物：AGGATGGCGTGAGGGAGAGC。按Trizol 说明书提取总RNA，测OD 值。RT 反应：30 ℃ 10 min，50 ℃ 20min，99 ℃ 5 min，5 ℃ 5 min；PCR 反应35 个循环，94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，58.8 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，72 ℃10 min。2%琼脂糖电泳，采用凝胶图像分析系统测 定电泳条带密度值。 统计学处理应用SPSS12.0 统计软件，数据以均数±标准差表示，采用配对t检验，P<0.05为差异有统计学意义。 应用肌酸肌酶抑制剂IA 阻断了细胞的肌酸肌酶（CPK），结果发现IA（30 μmol/L）与细胞作用4 h 后显微镜下见细胞变圆，6 h 后见细胞核增大，细胞溶解死亡。 AQP1免疫组化反应阳性产物呈深褐色，位于细胞膜上。与对照组比较，IA 作用于成纤维细胞4和6 h后细胞膜AQP1表达均显著增加。 AQP1蛋白的表达Western blotting 结果显示IA 与细胞作用4 h 后即可见AQP1 的表达增加，而6 h 后AQP1 的表达显表1 Balb/c 3T3 成纤维细胞表达AQP1 免疫组化平均光密度值 为进一步探讨能量代谢对AQP1 表达的影响，本研究采用诺考达唑干扰线粒体的功能以及应用叠氮化钠阻断细胞色素C 氧化酶（复合物IV），结果发现二者均可同样诱导细胞AQP1 的表达。 AQP1的基因调节为了解IA 诱导AQP1 表达的增加是否存在转录前的调节，本实验测定了AQP1 mRNA水平的变化，发现IA 作用4 h 后AQP1 mRNA开始增加，至6 h 后增加更为显著，表明IA 激活了AQP1基因。 从原核细胞到真核细胞，从单细胞到多细胞生物，能量代谢对生命的存在至关重要。在哺乳动物，作为能量主要载体的ATP 是由线粒体呼吸链上进行的一系列氧化还原反应而生成。它在肌肉中的主要用途是为肌肉的收缩和离子泵提供能量。其中，磷酸肌酸（PCr）是肌肉细胞中的另外一个主要的能量载体。肌酸激酶（creatine kinase，CK），又称磷酸肌酸激酶（CPK），位于细胞质和线粒体，催化肌酸（Creatine，Cr）和ADP之间高能磷酸键的转换。除肌肉组织外，CK 尚分布于诸如脑细胞、巨噬细胞、上皮细胞、内皮细胞及成纤维细胞这些非肌肉组织。目前认为CK是调节细胞呼吸的代谢控制系统和重要的抗氧化系统，并具有强大的神经保护效应。水与能量对生命必不可少，妥善处理能量及水代谢是生命体必备的功能。那么在长期的进化过程中水通道与能量代谢很可能存在着密切的关系。基于此，我们假设细胞能量代谢状态可能会影响水通道的表达或功能。因此，我们应用IA（一种特异性阻断CK 的酶抑制剂）阻断了细胞的CK，结果发现BALB/c 3T3 成纤维细胞在加入IA 后4 h 细胞形态变圆，6 h 细胞核增大，细胞溶解坏死。与之相对应，IA与细胞作用4 h 后AQP1 表达较0 h 增加24.4%，6 h 增加高达193.8%。免疫组化分析同样显示了IA 作用4、6 h 后AQP1 的表达显著增加。可见，影响细胞的能量代谢确实对AQP1 的表达产生了显著影响，证实了我们上述的假设。Leitch 等曾采用高渗山梨醇诱导了AQP1 的大量增加并认为其表达增加的原因是由于泛素化（ubiquitination，一种负责降解细胞蛋白质的物质）的减少及AQP1 蛋白稳定性增加使AQP1 的降解减少从而打破了蛋白质合成、降解的动态平衡，造成了AQP1 的累积。研究表明，泛素结合的蛋白被降解后，一种称为去泛素酶（deubiquitinating enzyme）可使泛素从结合的蛋白上脱落，使泛素失活。而IA 尚可作为脱泛素酶的抑制剂，如此推测IA 作用于细胞后应该造成AQP1 的减少，已知泛素具有ATP依赖性，那么IA 是否可能通过阻滞CK 而抑制细胞的能量合成使具有ATP依赖性的泛素失活，并减少了AQP1 的降解从而造成AQP1的增加尚需进一步的研究。最近，Schweitzer 等报道金黄色葡萄球菌α-毒素诱导AQP1 表达的机制与泛素化相关，α-毒素与IA是否具有共同的通路目前尚不得而知。为阐明IA 诱导AQP1 增加的调节机制，检测了IA 作用后细胞中AQP1 mRNA的表达，发现AQP1 mRNA的含量明显增加，尤以IA 作用6 h 后更为显著，说明IA 诱导AQP1增加存在着转录前的调节。已知正常时线粒体沿着微管分布，其功能的实施与微管密切相关。为进一步了解能量代谢影响AQP1 表达的机制，本研究通过应用诺考达唑阻断微管干扰线粒体的功能实施，同样诱导了AQP1 的表达。而且，采用叠氮化钠阻断线粒体呼吸链的细胞色素C氧化酶（复合物IV）也得到了相似的结果。可见，线粒体呼吸链代谢与AQP1 的表达密切相关。值得注意的是，细胞能量代谢障碍正是细胞缺氧时的病理生理改变。Echevarria 等发现低氧诱导了AQP1 基因的表达，并认为AQP1 具有氧通透性，可促进细胞氧的弥散。而另一项研究发现低氧诱导因子1α与AQP1 存在密切的关系。本研究结果提示这种低氧与α-毒素诱导AQP1 表达增加的核心很可能在于细胞能量的缺失，这或许指明了未来的研究方向。 我的相关日志：
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