反向点杂方法检测听神经瘤基因突变-脑外科专家顾建文教授-搜狐博客

听神经瘤是起源于听神经鞘的中枢神经系统常见的肿瘤之一，目前针对其的治疗主要是手术切除，但由于肿瘤与重要的脑干比邻，手术切除犹其是对巨大听神经瘤的切除常造成面神经瘫痪等严重影响疗效的并发症^[1]。目前研究已经证实肿瘤的发生是一个多基因改变及相互作用的过程，并且已有听神经瘤基因突变的报道。但有关听神经瘤发病分子机理及相关生物学特性研究的系统性报道尚未发现^[2-3]。以传统的杂交方法来检测听神经瘤组织中癌基因、抑癌基因和相关细胞分子的表达和突变情况，每次只能检测一种分子，难以同时发现多种基因的表达及突变。差式PCR或削减杂交方法无法对已知的基因进行检测。本文以改进的反向点杂交方法同时检测听神经瘤组织中42种已知分子的表达及突变，证实该方法是一简便有效的工具。

1. 材料与方法

1．1材料

常用的细胞因子、癌基因及抑癌基因（本校生化教研室保存）；尼龙膜（上海生工公司）；RNA点样器（自行设计制作）；α-³²p-dCTP和α-³²p-dATP（北京亚辉公司）；AMV反转录酶、Taq酶（TaKaRa公司）。

1．2方法

1．2．1点膜：将点样器与真空泵相连，上铺浸湿的滤纸，其上放置尼龙膜（经6×SCC浸泡），开启真空泵，将变性的基因点于膜上。

1．2．2标本取材：正常脑组织取自脑外伤后早期清创术，听神经瘤组织为术中取自肿瘤区，各为15例。

1．2．3 RNA提取及反转录：按照Promega公司RNA提取试剂盒Trizol方法提取听神经瘤和正常脑组织的总RNA，并按下列方法进行反转录：模板RNA 3μl；5×反转录缓冲液 4μl；10mMdNTPs 2μl；随机引物（0.5μg/μl）2μl；RNasin 1μl；oligodT_12-18（0.5μg/μl）2μl；AMV反转录酶 1μl；H₂O 5μl；42℃×1hr。

1．2．4 探针标记：用PCR标记法，反应如下：10×buffer 5μl；10mM dGTP 1μl；10mM dTTP 1μl；1mM dATP 1μl；1mM dCTP 1μl；cDNA 2μl；随机引物（0.5μg/μl）2μl；α-³²P-dCTP（10μCi/μl）5μl；α-³²P-dATP （10μCi/μl）5μl；H₂O 30.5μl；Taq酶（5u/μl） 0.5μl。反应条件为95℃15″-39℃4″-68℃50″×30cycle

1．2．5 杂交及曝光：预杂交及杂交、压X-片参见文献^[4]。

1．2．6 结果分析：实验结果均使用Spass软件进行χ²检验。

2. 结果

2．1 质粒的提取与点膜

常规方法提取质粒后，变性（100℃煮10分钟，立即置于冰浴中）然后点于尼龙膜上，点膜顺序如下：

BMP-1 BMP-2 BMP-3 BMP-4 BMP-5 BMP-6 BMP-7

IL-1 IL-3 IL-4 IL-6 IL-8 IL-11 IL-12

PDI TGF-α G-CSF GM-CSF TPO IFN-α IFN-γ

TNF VEGF A(1-3)^a Endostatin GH SOD β-^b

sis bax nm23 mdm2 Ras raf P16

P53 c-erbB₂ fos c-myc DCC ANG^cLRG-5^d

注： a angiostatin kringle(1-3)

bβ-葡萄糖醛酸苷酶

c Angiogenin(血管生成素)

d 脂多糖应答基因

2．2组织RNA提取

按照Trizol说明书，提取正常脑组织和听神经瘤组织的RNA，紫外分光光度计测定A260/A280均为1.8左右，电泳观察RNA带型较完整，表明提取过程中RNA降解较少（Fig 1）。

2．3探针标记与杂交

取部分RNA作模板，进行反转录，随后取2μlcDNA产物标记探针，标记方法是PCR标记法，按照所明书进行杂交，压X-线片（Fig 2）。

2．4基因表达情况初步分析：

从图中可以看出，GH、sis、mdm2、BMP-6、IL-3广泛存在于正常脑组织中和听神经瘤组织中，而且表达水平较高，IFN-α、IFN-γ在两种组织中有较低水平的表达。而P16、TNF、A（1-3）、DCC 基因的表达水平有较大差异（见Fig 3）。

传统杂交方法是标记某一特定探针，进而通过杂交方法检测该基因在各种组织中的分布及表达水平的高低。如检测肝癌中CD44基因的表达，则采用随机引物标记法或缺口平移标记法来标记探针，从肝癌组织中提取RNA，点于尼龙膜或硝酸纤维素膜上，然后杂交^[5]。该方法的优点是标记探针是唯一的，一般组织中只要有一定水平的表达即可检测出来，但该方法每次只能检测一种分子，无法对多基因同时进行检测并进行半定量的观察。本文所采用的反向点杂交技术是将已知的一些癌基因、抑癌基因及细胞因子等，点于尼龙膜或硝酸纤维素膜上，从相应的组织或细胞中提取RNA反转录成cDNA后以随机引物PCR，同时掺入放射性同位素以标记探针，与点于膜上的探针进行杂交。与以往的方法比较，反向点杂交法可同时检测多种基因的表达及突变情况，为在基因水平探索特定肿瘤的发生、发展及治疗提供了可靠的实验依据。

本文以反向点杂交方法检测正常脑组织和听神经瘤中42种基因的表达水平，初步分析结果显示：GH、sis、mdm2、BMP-6、IL-3等广泛存在于正常脑组织和听神经瘤组织中，而且表达水平较高，IFN-α、IFN-γ在两种组织中有较低水平的表达。而P16、TNF、A（1-3）、DCC 基因的表达水平有较大差异。P16是多重抑瘤基因，也称周期素依赖激酶4 /CDK4特异抑制蛋白，是比P53更直接与细胞病变有关的新型抑瘤基因，能够与CyclinD竞争CDK4，抑制CDK4对细胞生长分裂的正向作用，参与细胞周期调控，控制细胞G₁/S期的转化^[6]，本实验显示听神经瘤组织中P16有明显突变，可能与其发生相关。Angiostatin 是1994年才发现的一种内生性蛋白质，它是纤维蛋白酶原的前4个Kringles（简称K）片段的表达产物，分子量为38kDa，具有显著抑制血管内皮细胞生长的活性^[7]。1996年，Cao等^[8]对人angiostatin的K片段研究发现，K1，K2，K3均具有抑制血管内皮细胞生长的活性，而K4无此活性，实验结果显示听神经瘤中Angiostatin Kringles （1-3）的阳性表达明显低于正常脑组织，可能与肿瘤的血管新生和增值有关。在肿瘤细胞中，往往有TNF的突变，体内体外研究已经正实TNF可以抑制肝癌、胃癌及乳腺癌等恶性肿瘤的生长^[9-11]。听神经瘤中TNF 的突变提示其与该肿瘤的发生密切相关。IFN-α、IFN-γ目前也已证实可能与肿瘤细胞的周期调控、凋亡等相关^[12]。本法检测结果与目前报道相关基因的功能及在肿瘤发生中的作用相吻合。

本方法的缺陷是探针是以随机引物PCR标记的，理论上应该是所有基因均可以标记上的，但是由于本法的随机性，以及加入dATP和dCTP，α-³²P-dATP及 α-³²P-dCTP的量较少，可能有些分子未被标记，有可能使杂交结果出现一定的假阴性。

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脑外科专家 顾建文教授

反向点杂方法检测听神经瘤基因突变

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