脑外科专家 顾建文教授

很多抗生素耐药的细菌用常规的办法很难杀死它们。但是如果在手术后持续保持伤口部位的酸化环境，细菌就不能生存。所以再生氧化纤维素作为特殊的止血材料，可以在伤口产生酸化，导致细菌无法生存。从而在止血的同时，解决难以控制的耐药细菌感染。

摘要  背景：多耐药微生物的出现对于接受手术治疗的患者是十分危险的。氧化再生纤维素(ORC)产生的酸性pH值环境对引发手术感染的微生物的生存造成生理性破坏。本研究旨在考察ORC对抗生素耐药微生物的抗菌效果。方法：测定了ORC产品对ATCC参照株和临床分离的甲氧苯青霉素耐药金黄色葡萄球菌(MRSA)，甲氧苯青霉素耐药表皮葡萄球菌（MRSE），万古霉素耐药肠道球菌(VRE)，青霉素耐药肺炎链球菌(PRSP)，和无耐药性的ATCC金黄色葡萄球菌菌株和绿脓杆菌。将含有微生物的营养肉汤接种于三种ORC产品的样品（SURGICEL* 可吸收止血剂, SURGICEL*原纤维可吸收止血剂, 和 SURGICEL NU-KNIT*可吸收止血剂(*Ethicon的注册商标)分别命名为ORC-R, ORC-F,和ORC-N用于该研究）中，重量体积比为15 mg ORC/mL。在0, 1, 6, 和 24 小时进行平板细菌计数。结果：所有三种ORC产品对微生物均有抗菌活性。数据显示抗生素耐药微生物对ORC的抗菌活性依然敏感。对10种细菌中的9种，包括四种抗生素耐药的临床分离菌株(VRE, MRSA, and PRSP)进行测试，暴露于ORC24小时后，菌数下降超过3个对数级。ATCC菌株VRE对酸性pH效应有些许耐受。ORC-N能使VRE菌数下降3个对数级，而ORC-R和ORC-F对VRE菌数的降低作用不超过1个对数级。    结论：由于低pH会影响相对广谱的细菌，并且和抗生素的作用机制不同，抗生素耐药菌株对ORC产生的pH值效应似乎并没有耐受性。体外评估结果支持ORC的抗菌活性对抗生素耐药菌同样有效的假设。多耐药微生物的出现对于接受手术治疗的患者是十分危险的。抗生素耐药微生物引起的感染，对患者的治疗和康复十分不利[1]。因此在手术中应谨慎使用产品，使感染危险最小化。预防手术部位感染(SSIs)的发生是首要的。应该对革兰氏阳性菌给予特殊关注，因为它们含有从SSIs 分离的3种最主要的病原体，并且易产生抗生素耐药 性。包括金黄色葡萄球菌，凝固酶阴性葡萄球菌和肠球菌类。从1990年到1996年全国性的调查表明，金黄色葡萄球菌到SSIs致病菌中的20％[1]。该研究还表明，凝固酶阴性葡萄球菌占SSIs治病菌中的14％，而肠球菌占12％。氧化再生纤维素(ORC)作为止血药广泛用于外科手术中。而市场上也有其它几种止血产品，ORC是唯一已知有广谱抗菌作用的同类产品[2]。氧化再生纤维素由过氧化氮氧(N2O4)化纤维素生成[3]。Dineen率先发表了关于ORC体内和体外抗菌活性的讨论[2]。体外研究表面ORC对大范围的病原体都有抗微生物活性。这些研究采用抑制带测定（zone of inhibition assays），和使用置于酪蛋白胰酶水解物大豆肉汤中的ORC对多种不同微生物的定量检测。在豚鼠伤口感染模型中，证实ORC均有体内抗菌活性，与对照相比能预防脓毒症的发生[2]。在对脾切开术SPANGLER 等人体内模型的研究中，Dineen证实ORC在激发免疫反应后能有效减少细菌数[4]。在此外对杂种狗的研究中，在细菌攻击前将ORC用于主动脉补片，能降低细菌污染[5]。Pernet [6]报道ORC在体外对凝固酶阳性葡萄球菌，绿脓杆菌和醋酸钙不动杆菌有效。Dineen [4]特别指出ORC的作用机制可能是通过其pH效应，因为在体外用氢氧化钠能降低或者消除ORC的抗菌作用。Dineen报道称ORC在体外系统中的pH值约为2.5 [5]。他的结论为酸性环境对大多数微生物是致命的[4]。在另一报道中，Abaev等人的 [7]将纤维质材料暴露在浓度升高的N2O4中，并证实纤维素上的羧基数与其抗金黄色葡萄球菌的作用成正比。需要指出pH值4.4–9是多数微生物生存的极限范围[14]，包括葡萄球菌，假单胞菌，链球菌，大肠杆菌和其它与医源性SSIs相关的菌属。因为低pH值会影响相对广谱的细菌，并且和抗生素的作用机制不同，我们推测抗生素耐药菌株不会对ORC的pH值效应耐受。本文就ORC体外对抗生素耐药微生物的抗菌作用进行了评估。

 材料和方法  菌株 本研究中使用的菌株包括临床分离株和美国标准培养收集所(ATCC, Manassas, VA)的菌株。临床分离株(CI)由Robert Wood Johnson药学研究所(PRI)提供，包括甲氧苯青霉素耐药金黄色葡萄球菌(MRSA) (CIOC4159)，万古霉素粪耐药肠球菌(VRE) (CI-OC4328)，万古霉素耐药屎肠球菌(CI-OC4345)，和青霉素耐药肺炎链球菌(PRSP) (CI-OC4409)。测试的ATCC的菌株为MRSA (ATCC 33591)，甲氧苯青霉素耐药表皮葡萄球菌(MRSE; ATCC 51625)，VRE (ATCC 700221)，无耐药性金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)和绿脓杆菌(ATCC 9027)。

检测 将受试菌的存贮培养物接种于肉汤培养基中制备受试菌株接种物，于30–35°C孵育24小时。所有的受试菌株在胰酶解大豆酪蛋白肉汤(Difco, Grand Island, NY)中生长，除PRSP外，PRSP生长于脑心浸液(BHI)肉汤(Difco)中。

本研究设计用来就几种ORC的产品样品对微生物作用24小时后的效果进行评估。对三种不同的ORC产品进行评估：SURGICEL* 可吸收止血剂, SURGICEL NU-KNIT*可吸收止血剂，和SURGICEL*原纤维可吸收止血剂 (*Ethicon ，Somerville, NJ)。在本文中将产品分别命名为ORC-R, ORC-N, 和 ORC-F。

每份ORC样品均在无菌环境下分为重165mg（65mg）的小块。将样品置于无菌试管中，并接种0.1 mL 24小时的微生物。将11 mL肉汤加入每支试管中，制成约为15 mg ORC/mL的培养基。该重量/体积比主要根据之前Dineen [2]的研究，在其研究中，将2 cm²ORC加入10 mL培养肉汤中测定抗菌活性。所有受试菌株的测试培养基为胰酶解大豆酪蛋白肉汤，除PRSP外，PRSP使用的是BHI肉汤。加入肉汤培养基后，涡旋每支试管数秒。将试管中的培养物平均分为数份，然后用0.85%的生理盐水稀释，注入平皿中。除PRSP用BHI琼脂铺平皿外，所有的用胰酶解大豆酪蛋白琼脂(TSA) (Difco)铺平皿，因为PRSP的生长需要的营养复杂。分别在接种后0(接种后立即)，1, 6,和 24 h重复该过程3次。所有受试菌株的阳性对照为不含ORC的培养组，在0和24小时铺板。所有的平皿于30–35°C孵育24小时。随后计数，结果以菌落形成单位(CFU)/mL进行记录。

统计学分析  对于每种ORC/细菌混合物，求平均值并根据对数标度描点绘图。用Student’s t-检验分析数据，计算p值，以判断观察到的抗菌作用是否有显著性差异(p <0.05)。将每种菌株和每种ORC产品在0小时和24小时的读数差异与阳性对照进行比较。在小样本导致变量不同的假设下进行计算。阳性对照比其它实验样本的重复次数少。因此，为复合统计学计算，假设所有对照都与进行实验的阳性对照给出的数据相似。根据这些假设，对照组数据的重复次数与实验数据的重复次数相同。

 结果  本研究旨在就ORC产品对抗生素耐药 的临床分离株的抗菌活性进行评估。研究结果表明了所有3种ORC产品对9种菌株的抗菌活性。表1总结了3种ORC产品对细菌暴露24小时后的抗菌活性。T-检验的P值表明所有产品和未经过产品处理的阳性对照相比，均有抗菌活性。琼脂和生理盐水的无菌（阴性）对照在30–35°C孵育24小时后无菌落生长。所有阳性对照的微生物计数都增加至少两个对数单位。这表明细菌计数的降低与ORC降低生长培养基的pH值直接有关，因为ORC/肉汤/细菌在孵育24小时后的菌数呈对数级降低。

葡萄球菌测试 包括ATCC的甲氧苯青霉素耐药金黄色葡萄球菌菌株ATCC 33591 和上皮金黄色葡萄球菌菌株ATCC 51625 无耐药性金黄色葡萄球菌菌株，和甲氧苯青霉素耐药金黄色葡萄球菌临床分离株CI-OC4159 。临床分离株，ATCC MRSE株，以及无耐药性ATCC菌株的结果表明24小时计数的菌落数至少有6个对数级的降低 。图1a中，ORC-R和 ORC-F使 MRSA ATCC 33591的菌落数24小时时降低了约3个对数级，而ORC-N使菌落数降低了约6个对数级。

万古霉素耐药肠球菌和青霉素耐药链球菌测试 对于临床分离株，24小时ORC-R 和 ORC-F的菌落计数降低了3到4个对数单位，ORC-N的计数降低了5到6个对数单位。对于ATCC VRE菌株，ORC-R 和 ORC-F的菌落计数的降低不到1个对数单位，而ORC-N的计数降低了4个对数单位。这可能部分是某些VRE菌对低pH值耐受的原因。三种ORC产品测试的青霉素耐药链球菌(PRSP)计数都迅速降低。6小时的计数下降了至少5个对数级，并且计数在24小时的测试过程中持续较少。

绿脓杆菌测试 为了评估ORC对革兰氏阴性菌的抗菌活性，对绿脓杆菌ATCC 9027进行了测试。结果与之前Dineen [2]的报道一致。所有3种ORC材料对绿脓杆菌在短时间内起效，6小时的菌落计数下降至少3个对数级，24小时降低3到4个对数级。

讨论 已知微生物除其抗生素敏感性之外，其存活和生长也有一定生理方面的要求。包括合适的温度范围，营养，氧气（对厌氧菌而言是缺氧），湿度和pH值。人体能满足微生物生长所需的营养、温度、湿度和氧气。事实上所用的体液都能为细菌的最佳生长提供充足的营养[11]。极酸或极碱的环境都会有效限制微生物的生长和存活，该方法广泛用于食物，药品和化妆品工业[13]。近期有报道pH值4.4–9是多种微生物的生长限度范围[14]，这些微生物包括葡萄球菌，假单胞菌，链球菌和大肠杆菌，以及其它通常与SSIs有关的菌类。本研究的结构表明ORC降低pH值的效应在测试中能有效作用于所有临床分离菌株。根据近期报道，VRE的临床分离株比ATCC菌株 700221对ORC产品的抗菌作用更为敏感，ATCC 菌株700221是所有菌株中对ORC的低pH值效应耐受性最强的菌株。肠球菌菌株是本研究中对pH值耐受性最强的菌株。在发酵研究中，已发现某些肠球菌菌株能降低葡萄糖肉汤的pH值至4.2以下。某些肠球菌能够在pH9.6的环境下生长[10]，使之成为对pH值最不敏感的革兰氏阳性球菌肠球菌。然而，需要注意的是，本研究中使用的临床分离VRE株，对ORC的抗菌作用并没有明显的耐受性。

研究表明ORC-N对VRE的抗菌作用显著优于ORC-R 和 ORC-F。24小时对ORC-N的计数结果比其它两张ORC产品至少低两个对数级。虽然并没有对此差异进行全面的评定，但这可能是由于该产品基质的物理构型或者其编织结构所导致的。ORC-F是十分松散，相对较厚(>5 mm)的棉状基质，而ORC-R相对较薄(～1 mm)，为网状纤维状的编织物。ORC-N比ORC-R厚，是三种产品中最牢固的针织物，因此密度也最大。虽然所有的测试均在相同重量/体积比的基础上进行，针织物结构的产品可能是导致测试结果不同的原因之一。

正如本研究的结果所示，ORC有抗菌作用，极可能是Dineen之前报道的酸性环境引起的[5]。本研究的体外评估数据支持最近研究者的研究结果，并证实ORC引起的pH值抗菌效果对抗生素耐药的病原体依然敏感。