脑外科专家 顾建文教授

 一、突触与记忆：

近年来对突触传递过程的变化与学习记忆的关系进行了许多研究。在海兔（一种海洋软体动物）的缩鳃反射的研究中观察到，习惯化的发生是由于突触传递出现了改变，突触前末梢的递质释放量减少导致突触后电位减少，从而使反射反应逐渐减弱；敏感化的机制是突触传递效能的增强，突触前末梢的递质释放量增加。在高等动物中也观察到突触传递具有可塑性。有人在麻醉兔中，记录海马齿状回颗粒细胞的电活动观察到，如先以一串电脉冲刺激海马的传入纤维（前穿质纤维），再用单个电刺激来测试颗粒细胞电活动改变，则兴奋性突触后电位和锋电位波幅增大，锋电位的潜伏期缩短。这种易化现象持续时间可长达10小时以上，并被称为长时程增强（long-term potentiation）。不少人把长时程增强与学习记忆联系起来，认为它可能是学习记忆的神经基础。在训练大鼠进行旋转平台的空间分辨学习过程中，记忆能力强的大鼠海马长时程增强反应大，而记忆能力差的大鼠长时程增强反应小。

从神经生化角度看学习和记忆的机制 从神经生化的角度来看，较长时性的记忆必然与脑内的物质代谢有关，尤其是与脑内蛋白质的合成有关。在金鱼建立条件反射的过程中，如用嘌呤霉素（puromycin）注入动物脑内以抑制脑内蛋白质的合成，则运动不能完成条件反射的建立，学习记忆能力发生明显障碍。人类的第二级记忆可能与这一类机制关系较大。在逆行性遗忘症中，可能就是由于脑内蛋白质合成代谢受到了破坏，以致使前一段时间的记忆丧失。

二、突触可塑性与长时程增强

突触是神经系统内进行信息传递的结构基础。突触在其结构以及功能方面的可变性被称为突触可塑性。突触可塑性与神经系统的发育、损伤后的修复以及学习记忆等重要脑功能的完成密切相关;而在条件刺激下诱发的突触传递功能的长时程改变,即长时程增强(long-term potentiation , LTP) 和长时程压抑(long-term depression , LTD) 是突触传递功能可塑性的重要表现形式,也是研究学习与记忆的重要的细胞模型

　　由于神经系统内的信息传送过程,在同一神经元内是在轴突(由此形成神经纤维) 上进行的,在神经元之间则必须通过突触;又由于突触结构与功能的复杂性,以及影响信息在突触处整合的因素很多,因而信息经过突触后会产生不同的效应。同时,在传送信息的过程中突触本身的结构和功能又可发生变化,此即活动依赖性的突触可塑性。突触可塑性包括结构和功能两方面,突触形态结构的可塑性表现为突触活性区数量与面积的改变、突触间隙的变化以及各种亚细胞结构的改变等;突触功能的可塑性主要表现为突触传递功能的增强或减弱。而对机体活动造成直接影响的是突触(信息传递) 功能的可塑性。突触可塑性是神经系统可塑性的主要的和关键的内容。神经系统的可塑性对于完成其功能十分必要,神经系统许多重要功能的完成(如学习与记忆) 大多以突触可塑性为基础。因此,近几十年来,突触可塑性的研究一直受到国际神经科学界的高度重视。

长时程增强(LTP) 是突触传递功能可塑性的重要表现形式,是研究学习与记忆的细胞模型。长持续LTP (LL-LTP) 是进行长时记忆研究的细胞模型。近年来的研究资料表明,静寂突触转化为功能性突触可能是LTP 维持的重要机制。LTP 形成后,可以因生理性刺激或外源性刺激而出现反转。

　　三、LTP 现象及其形成机制

　　１、LTP ：LTP 一般是指在条件刺激(多为较高频率的强直刺激) 后,相同的测试刺激所引起的诱发突触反应长时间(一般长于半小时) 明显增大的现象。这种突触反应在不同的实验条件下可以有不同的表现形式,如可以是场电位、群体兴奋性突触后电位、群体锋电位、兴奋性突触后电位( EPSP) 或电流( EPSC) 等。

　　LTP 的全过程包括诱导和维持两个阶段,一般称其为诱导期和维持期(或表达期) 。诱导期是指强直刺激后诱发反应逐渐增大直至达最大值的发展过程,而维持期是指诱发反应达最大值之后的持续过程。由于不同脑区的LTP或同一部位不同刺激参数引起的L TP ,它们的诱导期与维持期的时间长短并不相同,所以一般又将LTP 形成早期(半小时左右)称为早时相LTP (early－phase LTP , E－LTP) ,将其后的阶段称为晚时相LTP ( late－phase LTP ,L－LTP) 。关于E－LTP 和L－LTP 在时间的划分上并不十分严格,这与不同研究单位使用的标准不完全相同或在不同脑区获得的研究结果并非完全一致有关。研究发现,LTP 的诱导期与维持期有着不同的形成机制[ 1 ] 。

2、LTP 的机制研究　由于LTP 是发生在突触部位的功能改变,所以它的形成机制研究主要指探讨参与其形成或调节的各种分子,包括参与形成的神经递质和受体,细胞内的信号转导机制,参与调节的神经递质、激素以及神经营养(细胞) 因子等。使用分子生物学的研究技术探讨不同基因在LTP 形成各阶段中的变化或作用,也是机制研究的重要内容。

当探讨LTP 的形成机制时,往往首先是从突触前机制或突触后机制进行分析。突触前机制是指引起突触传递功能增强的原因是由于突触前的变化,即在传入冲动相同的条件下,突触前释放更多的神经递质使突触传递功能增强。它的直接原因可以是由于每个囊泡的释放几率(probability of transmitter release , Pr) 增加,或每个囊泡所含递质量的增加,或释放递质的位点(活性区) 增加。突触后机制是指突触传递功能增强的原因是由于突触后的变化,即当突触前释放相同的神经递质时可引起突触后反应增强。其直接的原因主要是离子通道的效能改变。而离子通道功能改变的原因可以是相应受体的数量、亲和力的变化,也可以是突触后神经元内信号转导的变化改变了离子通道或受体的数量与功能等。因此,关于LTP 形成的突触后机制,研究的范围十分广泛,涉及到从膜受体转移到基因表达各个过程与多种分子[2 ] 。

3、LTP 形成机制的研究经常使用脑片膜片钳技术,这是因为脑片标本可提供与在体相似的突触结构与神经环路,膜片钳技术是研究突触电流和电位变化的理想技术。

4、近年来电生理学与形态学的研究表明,在神经系统发育早期,大部分的兴奋性突触在突触后膜上实际只分布有NMDA 受体,而没有AMPA 受体。这种发育不成熟的突触不具有正常的信息传递功能,属于突触后静寂突触。因为在静息膜电位时,NMDA 受体耦联的离子通道被Mg2 + 所阻塞,突触前释放的谷氨酸与突触后的NMDA 受体结合,并不能引起钙离子和钠离子的内流,不能产生EPSC 或EPSP。而只有当突触后膜去极化,Mg2 + 被移开时,NMDA 受体才具有突触传递的功能。随着发育过程,这些未成熟的静寂突触获得了功能性的AMPA 受体后,便具有了正常突触传递的功能。静寂突触转化为成熟的功能性突触,是脑内神经元回路在生后发育过程中的共同特征[7 ] 。　　　

此外,在研究LTP 形成机制时发现,LTP的维持往往伴随有突触后膜AMPA 受体的增多,即也有突触后静寂突触转化为功能性突触的机制的参与。LTP 形成过程中AMPA 受体快速插入到突触后位点的假设,近年来已被大量实验所证实。在研究LTP 维持与表达机制时发现,随着LTP 的形成,非突触部位的AMPA 受体可移动到突触部位并插入到突触后膜上。将海马脑片的AMPA 受体亚单位用绿色荧光蛋白进行标记,并用光学方法观察后发现,绿色荧光蛋白标记的亚单位在静息时主要集中在树突柄,较少存在于树突棘(形成突触后成分) ,且在未接受刺激时很少移动;而给予高频刺激诱发LTP后,绿色荧光蛋白就会出现于树突棘上[8 ] 。因此,AMPA 受体在静寂突触上的重新分布被认为是LTP维持或表达的突触后机制之一。

　　四、长持续LTP ( long－lasting long－term potentiation , LL－LTP)的研究及其应用

1、LL－LTP 的提出及其诱发条件　在探讨LTP 的形成机制时,研究者一般根据LTP 的持续时间将各种条件下形成的LTP 分为E－LTP 和L－LTP。这种分类方法主要是考虑不同时相的LTP有着不同的维持机制,但没有考虑诱导条件在其中发挥的作用。1991 年Nikolaev 等人观察了不同刺激参数对整体动物LTP 维持时程的影响。研究发现,高频强直刺激诱导的LTP 维持时间长,而低频刺激诱导的LTP 维持时间短;他们将持续时间长于3 h 的LTP 称为LL－LTP[ 9 ] 。

自LTP 被发现以来,在30 多年的时间里,大量的研究证实LTP 与记忆形成的分子机制有高度的一致性,LTP 已被广泛地认为是研究记忆的最佳细胞模型[10 ] 。另外,对于LTP 饱和特性的研究发现,当海马的LTP 饱和时, 可明显损害大鼠的空间学习[11 ,12 ] 。这一发现进一步肯定了LTP 作为学习记忆替代模型的重要研究价值。近年来又有研究报道,特定的高频刺激作用于大鼠的齿状回可以引起非常稳定的LL－LTP ,在整体动物诱导的LL－LTP 可以持续几个月, 甚至可长达一年[ 10 ] 。基于研究发现的LL-LTP 特征,犹如LTP 作为研究学习记忆的细胞模型一样,LL-LTP 也被作为研究长时记忆的细胞模型[10 ,13 ] ,被用于探讨长时记忆的巩固和维持。但是由于LL-LTP 研究所需的实验时间长,维持研究标本在长时间内具有良好状态和稳定的兴奋性比较困难,所以关于LL-LTP 的研究资料较少。

近年来,西安交通大学医学院生理实验室韩太真等报道，对成年大鼠海马和发育大鼠视皮层脑片标本的LL-LTP 形成规律与特征进行了观察。研究发现,在发育大鼠的视皮层脑片标本上,所使用的高频和低频强直刺激均可一次性引起LL-LTP。其中使用低频强直刺激参数诱导的LL-LTP为NMDA 受体依赖性的。双脉冲比率测定的方法表明,所用低频强直刺激参数诱导的LL-LTP的维持机制主要是突触前递质释放概率的增加。由此提示该参数诱导的LL2L TP 维持机制可能主要是突触前的。所使用的高频刺激也是视皮层LL-LTP诱导的适宜参数,但该参数诱导产生的LL-LTP 伴随有平均突触活性区面积增大等超微结构的改变,表明它所诱导的LL-LTP 的维持机制主要是突触后的[14 - 16 ] 。

该实验室在成年海马CA1 区的研究表明,当刺激频率与总脉冲数均相同而脉冲的组合形式不同时,其诱导海马LL-LTP 的效能完全不同[17 ] 。虽同为高频强直刺激,单串与多串刺激诱导效果不同。多串刺激可一次性诱导出持续时间长于3h 的LL-LTP。这些研究结果提示,刺激脉冲的不同组合形式可能具有不同的生理效应。此外研究还发现成年大鼠海马CA1 区LTP 的诱导参数具有性别二态性,雄性大鼠能够对较为广泛的强直刺激发生有效反应[18 ] 。在神经系统内,神经纤维上传导的动作电位(尤其是其主要成分锋电位) 是传递信息的重要载体。由于动作电位的“全或无”特性,同一神经纤维上传输的不同信息实际上编码在动作电位的不同排列组合形式中。因此,研究不同刺激形式对于特定神经生理过程的影响,是神经科学研究中的基本问题[19 ] 。近年来,一个新的观点越来越引起神经科学界的关注,即神经系统内输送的信息是编码在锋电位的精细时程排列中,而并非编码在锋电位的平均频率上[ 20 ] 。鉴于使用同样的低频强直刺激参数在海马诱导出LTD , 而在视皮层却能诱导产生LL-LTP ,由此表明了不同脑区对诱导产生LL-LTP 的强直刺激参数的敏感性不同。

2、LL-LTP 的反转　以往有研究发现,在LTP 形成后,可以被后续的外来刺激所反转( reversal) [ 21 ] ,这一现象也称为去强化作用。而引起LTP 反转的外源性刺激具有输入的通路特异性[ 22 ] 。研究还发现,LTP 形成后或突触修饰后的反转不仅可由外源性刺激引起,也可以是生理性活动所触发的脑内的自然过程。如成年大鼠海马部位形成的活动依赖性LTP ,可因为动物进入一个新环境而被反转[23 ] 。但是,较多的研究资料显示,LTP 的反转只出现于LTP 的早时相。即一般在L TP 诱导后很短时间内(10 min～30 min) ,在同一输入通路上施加低频刺激时才能引起其反转。普遍认为,L-LTP 或LL-LTP 形成后,很难被外源性的刺激所反转。但近年来有研究报道,当高频刺激在整体大鼠上引起稳定的LTP 后,如果从第14 天开始让动物反复暴露在一个内容丰富的环境中,已形成的、稳定的LL-LTP 仍可以被反转[24 ] 。西安交通大学医学院生理实验室韩太真等近来的研究发现,在成年大鼠的海马脑片标本上,当外源性电刺激诱导出LTP 1 h 后,在同一刺激通路施加特定的强直刺激,可使已形成的LTP 发生反转;并且,当使用代谢性谷氨酸受体的拮抗剂后,这种反转的时程可以被延长。